骨缺损修复--细胞移植及其载体选择

　　大块骨缺失和萎缩性骨不连的治疗常十分困难。理想的治疗方法不但要恢复骨的完整性和连续性，而且还要尽可能缩短这种恢复所需要的时间，使骨骼尽早获得正常力学性能，避免因不负重或制动时间过长而引起的废用性肢体功能丧失。
目前常用的治疗方法包括自体或异体骨移植(松质骨或皮质骨)、人工骨(羟基磷灰石或生物陶瓷等)移植以及各种骨诱导剂(转移生长因子TGF-β或骨形态生成蛋白BMP)与人工骨的结合应用。
从骨形成的生物学特性来看，理想的骨移植物应包括三种要素：骨生成性、骨传导性和骨诱导性[1]。因此，除新鲜自体骨外，目前还没有一种理想的骨移植复合物同时具有上述三种要素，而达到新鲜自体骨移植的效果。

l 骨生成性(osteogenesis)
       骨生成性指的是骨移植物的骨形成能力，也就是移植物本身是否带有能形成骨组织的细胞[1]。目前常用的骨移植物中，只有新鲜的自体骨具有这种骨生成性。为了弥补其他移植物骨生成性的缺乏，通常采取髓腔再通、骨膜保留和局部的富血供化等措施，希望髓腔或骨膜部位的骨生成细胞能进入到骨缺损处。但其效果并不令人满意。这主要有两种原因(不考虑异体骨的免疫性)：1. 这几种移植物的成骨修复过程一般要经过以下几个步骤：有成骨潜能的细胞的迁移、增殖、分化、成骨以及新骨的整合和塑型。在这个过程中，细胞的迁移非常缓慢，从而使得骨形成过程相当漫长。2. 骨形成过程的起始与成骨细胞数量、密度有关，只有当成骨细胞密度达到一定程度(5′105/36mm3)时，才开始有骨形成[2]。但是，骨髓中的成骨潜能细胞数量非常有限，仅为成纤维细胞的万分之一[3]，而且随着年龄的增长逐步减少[4]。由于这两种原因，在漫长的骨形成完成之前，移植物有可能已经或正在被吸收，失去了为新骨提供支架的作用。
        因此，尽量缩短细胞的迁移时间和提高细胞的初始密度，有利于增强骨生成性、加快骨形成。
m 自体骨髓的成骨特性
       1982年，Takagi用小鼠的自体骨髓移植，来修补其股骨的节段性缺损，获得成功。实验中他发现如果封闭髓腔残端，则没有新骨形成。如果髓腔封闭后再植入自体骨髓，则可见明显的骨形成。Nade将自体骨髓结合生物陶瓷进行异位移植，也见到了骨组织的形成。
       在此基础上，有人进行了一组对照研究，自体骨髓加多孔陶瓷组植入小鼠股骨节段性缺损部，有非常明显的骨形成，并与残端有良好的整合，而单纯的陶瓷组的骨形成却要少得多。由此可见，把具有成骨潜能的细胞直接植入缺损部位，在特定时间段内可见明显的骨形成，也就是说，这种植入加快了成骨速度，这主要是因为省去了缓慢的细胞爬行时间。
不过由于骨髓中的成骨潜能细胞的数量较少，这种简单的移植后还需要有一段细胞增殖时间(新鲜自体骨移植也有同样的问题)，达到一定细胞密度后，才开始骨形成。
m 骨髓间充质干细胞
       一般认为骨髓含有两类组织成份：造血干细胞和其分化的子代细胞，以及称为基质的结缔组织。在基质中又存在着无成骨性的脂质细胞、网状细胞、内皮细胞和成纤维细胞。但骨髓基质中还存在一种能对BMP起反应的细胞。如果进行骨髓培养，在培养的细胞中会有一种碱性磷酸酶(AKP)阳性细胞，其AKP活性能被甲状旁腺素抑制、VitD3促进，而且在VitD3存在的情况下，其骨钙素合成增加。进行骨髓异位培养可有胶原性基质形成 ，为Ⅰ型和Ⅱ型胶原[21]。在鼠体异位培养中，骨髓细胞有骨、软骨组织形成。基于以上几点，W?odarski认为这些细胞可能来源于间充质细胞，因为骨、软骨、肌腱等本来就发生于胚胎的中胚层，在特定的条件下，间充质细胞能发育成前成骨细胞和前成软骨细胞[2]。随后的实验进一步发现骨髓细胞在血供丰富的部位形成骨，缺乏血液的地方则形成软骨，这与胚胎骨、软骨的发生非常相似，而且这些部位的细胞形态与成骨和成软骨细胞非常接近。Caplan把这一类细胞称之为间充质干细胞(mesenchymal stem cells)[5]。它与造血干细胞一样是具有多分化潜能的增殖型细胞，在特定的条件下，分化后能够形成骨[3，6，7，8，9]、软骨[10，11，12]、肌腱[13]、脂质细胞[14]和支持造血干细胞分化的结缔组织细胞[15]。
          近来的研究证实这类细胞的确是一种独立的细胞系，而不是由其他细胞分化而来的。其表面受体存在特异性[16](如CD44[17])，不具有造血系细胞独有的CD14、CD34和CD45等表面抗原[18]。
       Goshima首先对间充质干细胞进行了分离培养。他发现骨髓细胞培养一段时间后，出现一种成纤维细胞样的梭型贴壁细胞，具有成骨和成软骨活性，他认为这种细胞就是间充质干细胞[6]。Haynesworth证实这种细胞移植后的局部成骨反应的确来源于该种细胞，而非宿主细胞[19]。随后的报道进一步表明不论鼠、兔、狗和人，通过这种方法培养增殖的细胞都具有成骨和成软骨特性，而且这种特性不因供体的年龄而改变[7，8，9，11，12]。另外，这种细胞形成的骨组织中可出现骨髓样组织[7]。1998年Bruder利用培养的间充质干细胞结合多孔生物陶瓷移植，成功地修复了狗股骨节段性缺损[20]。
       这种细胞在骨髓中数量很少，在狗大约占骨髓有核细胞的1/25000[12]，而人约为狗的1/4[3]。但他们的增殖速度很快，Bruder研 究表明，人的间充质干细胞在原代培养的初始约为500个/培养皿，到原代培养末期能扩增到6.1′105，传代后以每两天倍增一次的速度扩增，这种几何级数的扩增能持续10代左右[8]。而且随着细胞的增殖，其细胞性状和分化潜能并不会改变和丧失[3，6，8，9]。一般认为人的骨髓每毫升有200个左右的间充质干细胞，在体外可以倍增30次，那么，细胞总数将达到最初的十亿(230)倍，这相当于数千升的骨髓。因此，这种易扩增性使得我们只要进行很短时间的培养扩增，就能产生足够数量的细胞来填充骨缺损部位。
        骨髓间充质干细胞具有良好的骨生成性，其可分离、易培养扩增特性不但很好地解决了骨髓中成骨潜能细胞数量不足或局部缺乏(萎缩性骨不连)的问题，也解决了骨生成性方面的两个难题(迁移速度和初始密度)，大幅度缩短骨缺损修复时间。

l 载体的选择
       当选择间充质干细胞作为骨形成来源时，也应选择一种合适的细胞载体，并为细胞提供适宜的局部环境和成骨支架。Goshima曾把细胞直接注入动物体内，结果发现没有骨形成[6]。临床上也有类似现象，一个较大的新鲜骨缺损的自行修复通常是不完整的，并不能把整个缺损空间填满。
        理想的载体应该具有良好的生物相容性、骨传导性、一定的骨诱导性、可生物降解、有利于细胞贴附和血管长入，以及一定的抗负荷能力[1，15]。目前可供选择的载体可分为两大类：同种异体骨和人工合成骨，每一类又可细分成数种。不过最常用的只有两种，冻干异体松质骨和多孔生物陶瓷。
        植入物应当尽可能少地引起宿主排斥和异物反应。炎症不但阻碍骨形成，而且还会引起细胞死亡。常用的人工合成骨具有良好的生物相容性，尚未见其引起明显炎症反应的报道。异体骨会引起一定的免疫排斥反应。目前认为其免疫原性来自于骨组织中的细胞，而非骨基质成份。当异体骨经过冻干处理后，其抗原性能被降到最低[1]。最近已有研究发现，通过免疫诱导耐受，能消除或减低宿主对新鲜异体或异种骨的免疫排斥。
       所谓骨传导性是指载体为新骨形成提供支架的特性。没有这种支架，新骨很难形成，即使能够形成，也将是杂乱无章毫无用处的骨组织。骨传导性取决于植入物内在的构造。首先必须具有一定的孔隙率，提供足够的面积供细胞附着，便于血管长入和以后的降解。皮质骨移植常不能获得满意的骨形成，并遗留下死骨，正是因为其缺乏应有的孔隙率[1]。骨组织只能在那些能保护成骨细胞免受其他组织侵袭(encroachment)的孔隙中形成[21]。另外，孔的大小也会影响成骨活动，过小的孔径没有足够的空间供细胞生长和营养血管的长入，影响细胞分泌基质和营养物质的渗入。Nade认为孔径应大于100mm，最好在200-400mm之间[21]，过大的孔径则会影响载体的力学性能。目前的多孔生物陶瓷已能完全满足这两个条件，并可观察到血管长入和新骨形成[6]，但是它不能满足骨传导性另外一个条件--孔隙的连通性。孔隙不相通使得新骨之间不能相互连接，而缺乏连续性和整合性     (incorporation)，血管常不能进入到这些孔的盲端，因而在这个部位只能形成软骨样组织[6，19，22]。总之，载体只有具备了类似松质骨样的结构，才能获得最佳骨传导性[23]。另外，人工骨只是一种无机材料，缺乏细胞附着所需的整合素和附着性受体等有机物质[21]，细胞吸附能力可能要小于天然骨。
        单纯的人工骨没有骨诱导性。当其携带间充质干细胞植入骨缺损部位时，细胞的分化将依赖于缺损部的局部环境。问题是骨缺损部位常常不能提供适宜的骨诱导环境。有人试着把细胞诱导因子结合到人工骨上[21]，增加其骨诱导性，但是结合的量非常有限。细胞分化需要许多因子共同参与，单纯的一种诱导成份作用有限。目前已知的存在于骨基质中的骨诱导物质除了TGF-b、BMP、PDGF(血小板衍生生长因子)、IGF(胰岛素样生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)外，骨基质的其他成份也有骨诱导作用[24，25]，例如，整合素和附着性受体[21]、Ⅰ型胶原[7]等。目前已知冷冻的骨组织仍保留有这些诱导成份，冷冻干燥处理后的情况则有待于证实。
        从上面讨论的载体要求来看，最符合要求的首推自体松质骨。当自体骨来源受限时，冻干异体松质骨可能要优于多孔生物陶瓷。目前还没有见到异体骨做载体的报道，这可能是由于冻干处理不能去掉异体骨可能携带的传染性病毒[26]或供体骨本身的病变[27]。不过只要严格选择供体，可将这种可能性降到最低程度。

l 总结
         理想的骨移植物应当具备骨生成性、骨传导性和骨诱导性。当新鲜自体松质骨不能满足临床需要时，间充质干细胞结合冻干异体骨移植有可能获得接近于新鲜自体松质骨的效果，不仅可以治疗骨缺损、骨不连，而且还能加快因成骨细胞不足而愈合缓慢的老年性骨折。但这个推测尚需证实。目前在这一方面还有一系列的问题没有阐明。例如：
人体细胞特别是这种多潜能增殖型细胞的体外培养是否会改变这些细胞的正常生物学性状，而使细胞获得恶性特征？现有的资料都没能回答这个关键问题。
        另外，间充质干细胞目前已经能在体外被诱导为成骨细胞。从加快骨形成的要求来看，这种体外诱导的成骨细胞似乎最理想。不过成骨细胞属于功能型终末细胞，增殖能力和寿命有限[17]，当其凋亡后，局部又会再次出现骨生成性的缺乏。而且这种分化细胞在传代培养后常常失去其固有的表型属性(phynotype property)[14]。因此，从兼顾两者考虑， 部分诱导应该是最佳选择，而且，已分化的细胞能够分泌细胞因子，反过来促进间充质干细胞的增殖和分化[26]，从而进入一个良性循环。当然最佳诱导比例也有待于进一步的研究。
        为了最大限度提高局部细胞密度，就要尽可能多的将细胞转移到载体上。这过程中的条件控制同样有待摸索。
最后，间充质干细胞结合异体骨移植优于间充质干细胞结合多孔陶瓷移植只是一种理论上的推测，其实际效果也需要验证。

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